Varstvo gozdov Slovenije

Priprava trajnih preparatov bulic (hiperplazija) z debla navadne bukve (Fagus sylvatica L.) iz Stoperc, Haloze

Avtor(ji): Jožica Gričar, Gregor Skoberne, Tanja Mrak, Peter Prislan
Leto: 2017
Uvod in namen dela

Decembra 2016 smo s posredovanjem dr. Nikice Ogrisa od Nenada Zagorca, univ. dipl. inž. gozd., prejeli vzorec bukove skorje z območja Stoperc, Haloze, z nenavadnimi bulastimi izrastki (hiperplazija) (Slika 1). Pripravili smo preparate skorjinih tkiv za svetlobno mikroskopijo (svetlo polje in UV-fluorescenca), da bi preverili njihovo anatomsko strukturo.

Slika 1: Deblo navadne bukve (Fagus sylvatica L.) iz Stoperc, Haloze, s številnimi bulastimi izrastki (Foto: N. Zagorac).

Priprava preparatov

Pripravili smo preparate prečnih prerezov skorjinih tkiv za opazovanja s svetlobnim mikroskopom. Vzorec skorje odvzet iz debla navadne bukve (Fagus sylvatica L.) smo shranili v fiksacijski raztopini FAA (mešanica formalina, ocetne kisline in 50 % etanola), da bi ohranili strukturo celic in preprečili njihovo razpadanje. Po približno enem tednu smo tkiva za nekaj dni potopili v 50 % etanol in v nadaljevanju v 70 % etanol. Iz vzorca smo na različnih delih odvzeli manjše kose za podrobna drevesno-anatomska opazovanja pod svetlobnim mikroskopom. Kose smo nato v tkivnem procesorju (Leica TP 1020) dehidrirali v etanolni vrsti (70 %, 90 %, 95 % in 100 %) in raztopini bio-clear ter jih prepojili s parafinom segretim na 60°C. Različno orientirane vzorce smo nato s pomočjo parafinskega dispenzerja (Leica EG 1120) vklopili v parafinske bloke. S polavtomatskim rotacijskim mikrotomom (Leica RM 2245) smo narezali rezine debeline 10 µm, ki smo jih za opazovanja v svetlem polju obarvali v vodni mešanici barvil safranin (0,04 %) in astra modro (0,15 %) ter prepojili z vklopnim medijem Euparal. Safranin lignificirana tkiva obarva rdeče, astra modro pa nelignificirana tkiva (celuloze, hemiceluloze) modro (Gričar 2007, Prislan in sod. 2014a, b). Za opazovanja s pomočjo UV- fluorescence smo rezine obarvali z barvilom akridin oranžno in vklopili v glicerin (Prislan in sod. 2009).

Za klasično anatomsko opazovanje smo uporabili svetlo-poljsko mikroskopijo, za dokazovanje prisotnosti polifenolov (npr. suberina in lignina) pa UV-fluorescentno tehniko. Suberin in lignin namreč izkazujeta UV-fluorescenco in se svetita. Raziskave v svetlem polju smo opravili s svetlobnim mikroskopom Leica DM 4000 B/M ter fotografije zajeli s sistemom za analizo slike (kamero Leica DMC 4500 in programom Leica LAS). Za UV-fluorescentno tehniko smo uporabili mikroskop ZEISS AxioObserver.Z1 in modro UV-svetlobo ob uporabi kombinacije vzpodbujevalnega filtra 390-420 nm in emisijskega filtra 450-4095 nm (Prislan in sod. 2009). V UV-svetlobi je vidna rumeno-zelena fluorescenca lignina in modra fluorescenca suberina.

Anatomske analize in zaključki

Vzorci skorjinih tkiv bukve kažejo izrazito anomalno anatomsko strukturo na mestu bulic v primerjavi z normalno skorjo (Slika 2, 4). Netipična zgradba je omejena na periderm (sekundarno krovno tkivo) in zunanji kolabirani del floema (starejši del floema). V obeh tkivih je na opazovanem (prizadetem) delu število celic večje (hiperplazija) in njihova razporeditev neobičajna (Slika 4a-e). V osrednjem delu bulic lahko na prečnem prerezu opazimo konkavno razporeditev slojev periderma, med katere so ujete tudi skupine sklereid, ki so sicer značilne za floemsko tkivo. Z UV-fluorescenco je videti, da so peridermska tkiva močno suberizirana (modrikasta svetleča barva). Tkiva sekundarnega floema so močno lignificirana (rumeno- zelena svetleča barva). Oblika in velikost posameznih celic v floemu in peridermu se ne razlikuje od tistih v normalni skorji (Slika 2, 3, 4f-j). Sklepamo lahko, da gre za lokalizirano neobičajno reakcijo (v smislu povečane produkcije celic – hiperplazija) plutnega kambija (felogena) in živih celic (parenhimskih celic) v okoliškem tkivu. Vzroka za tovrstno reakcijo na podlagi anatomskih analiz ni mogoče določiti.

Bulice ali večje izrastke na drevesih pogosto opisujemo kot rastne anomalije. Dostikrat jih imenujemo tudi tumorji, saj so velikokrat povezani s patološkim razvojem tkiva, z značilno nenormalno, povečano rastjo, ki, kot kaže, ni več pod nazorom prvotnega genskega zapisa drevesa (Richter 2015). Vzrok za nastanek bulic je lahko infekcija kambija s patogenim organizmom ali neobičajen nastanek epikormskih poganjkov na deblu, ki se razvijejo iz zavrtih ali adventivnih popkov (Torelli 1990, Richter 2015).

Slika 2: Tipična skorjina tkiva pri bukvi: (a) Prečni prerez skozi celotno skorjo. Na vrhu slike je viden periderm (sekundarno krovno tkivo), sledi kolabirani floem, najmlajši nekolabirani floem, kambij in najmlajša branika v lesu. Sklerenhimski čep (ST) predstavlja skleroziran floemski trak, ki se nadaljuje v les. (b) Periderm je sestavljen iz felogena, ki v centrifugalni smeri proizvaja celice felema oz. plute, v centripetalni smeri pa celice feloderma. (c) Radialni prerez floemskega tkiva, kjer je razvidna dolžina aksialnih parenhimskih floemskih celic in sklereid (Skl.), ki so obdane s kolabiranimi stenami sitastih celic. (d) Najmlajša nekolabirana floemska branika s sitastimi cevmi (Sit. c.) in aksialnimi parenhimskimi celicami (Aks. par.), ki so številne v kasnem delu floema. Daljica = 100 µm (iz: Prislan 2012).

Slika 3: Običajna starejša skorjina tkiva bukve z UV-fluorescenco. Peridermska tkiva so suberizirana (modrikasta svetleča barva) in označena z zeleno puščico, sklereide starejšega sekundarnega floema pa lignificirane (rumeno-zelena svetleča barva) in označena z rumeno puščico.

Slika 4: Starejša skorjina tkiva bukve z bulicami v svetlem polju (a-e) in z UV-fluorescenco (f- j). Peridermska tkiva so močno suberizirana (modrikasta svetleča barva) in označena z belo (a-

e) ali zeleno puščico (f-j), sklereide starejšega sekundarnega floema pa so lignificirane (rumeno-zelena svetleča barva) in označene s sivo (a-e) ali rumeno puščico (f-j).

Viri

GRIČAR J. (2007) Xylo- and phloemogenesis in silver fir (Abies alba Mill.) and Norway spruce (Picea abies (L.) Karst.). Studia forestalia Slovenica, Professional and Scientific Works, Ljubljana, 106

PRISLAN P., MERELA M., ZUPANČIČ M., KRŽE L., ČUFAR K. (2009) Uporaba izbranih

svetlobno mikroskopskih tehnik za raziskave lesa in skorje Les, 61: 222-229.

PRISLAN P. (2012) Večletno in sezonsko nastajanje ksilema in floema pri bukvi (Fagus sylvatica L.) z dveh rastišč v Sloveniji. Doktorska disertacija, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Ljubljana. 143 str.

PRISLAN P., GRIČAR J., ČUFAR K. (2014a) Wood sample preparation for microscopic analysis. Ljubljana: University of Ljubljana, Department of Wood Science and Technology: Slovenian Forestry Institute: University of Zaragoza, Department of Geography and Regional Planning. Povezava.

PRISLAN P., MARTINEZ DEL CASTILLO E., KRŽE L., HABJAN P., MERELA M., REIJNEN H. (urednik). (2014b) Wood sample preparation for microscopic analysis: based on a protocol by Peter Prislan. Ljubljana: University of Ljubljana, Department of Wood Science and Technology: Slovenian Forestry Institute: University of Zaragoza, Department of Geography and Regional Planning. Povezava.

RICHTER C. (2015) Wood characteristics: description, causes, prevention, impact on use and technological adaptation. Cham: Springer International Publishing, Švica. 222 str.

TORELLI N. (1990) Les in skorja. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za lesarstvo, Katedra za tehnologijo lesa. 70 str.

na vrh strani